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林鑫，武國慶
［1.國家能源生物液體燃料研發（實驗）中心，北京 100020；2.中糧營養健康研究院生物技術中心，北京 102209］
近三四十年來，為保障能源安全、減少大氣污染及發展農村經濟，燃料乙醇異軍突起，乙醇汽油應用規模逐步增加，使得傳統釀酒工藝進入液體能源領域。伴隨原料的轉換，在化學工程和發酵工程等學科的交叉帶動下，逐步孕育了纖維素乙醇工程這一新的分支。
2012年完成的中試經濟評價為纖維素乙醇產業化奠定了基礎，在技術指標上雖與玉米乙醇有一定距離，但已初步具備產業化條件。文章概述了纖維素乙醇工業化在原料、酶制劑成本、發酵效率、能耗和水耗、專用裝備方面所面臨的主要挑戰，在此基礎上總結了纖維素乙醇預處理、酶解、發酵關鍵技術的研發進展及其在產業中的應用，討論了研發的熱點和難點，并對產業化發展模式及今后的技術發展方向作了展望。
自20世紀70年代以來，為緩解石油短缺、解決“三農”問題、推進生態環保，燃料乙醇產業得以發展，使用量逐年增加，2014年世界燃料乙醇產量已達到7400萬噸，由傳統的釀造領域跨入液體運輸燃料領域。近十年來，在向非糧原料轉換的過程中，纖維素乙醇工程這一新興學科分支逐步形成。
纖維素乙醇較第一代燃料乙醇在能量投入產出、溫室氣體減排方面有較大的優勢，作為第二代燃料乙醇已在美國、巴西、歐洲、中國等國家/地區建成上百套中試裝置，2012年纖維素乙醇完成中試技術經濟驗證后，示范裝置也已陸續開始建設。截至2014年底，世界已有8套裝置投入試運行，累計產能超過40萬噸/年。表1列出了世界主要纖維素乙醇示范裝置，預計到2017年，全球至少有25個項目投產，纖維素乙醇年生產能力超過100萬噸。
經過多年中試研發的努力，示范裝置的技術水平已達到較高的程度，采用先進技術的纖維素乙醇酶解底物固含量已達到25%，得到糖濃度達140g/L，發酵后乙醇濃度接近6%（質量分數）。然而，這與技術成熟、發酵乙醇濃度超過15%（質量分數）的玉米乙醇相比，整體經濟性還有待提升。
1纖維素乙醇工業化遇到的主要挑戰
剖析纖維素乙醇的各個工藝過程，遇到的主要問題可以歸納為以下五個。
一是原料。包括所需原料的獲取以及收儲運的專用設備與設施。在我國，農民家庭是農業中最主要的生產經營主體，2012年農村居民家庭經營耕地面積為2.34畝/人（1畝約為666.67平方米），這種經營方式導致原料來源分散，加之一些地區道路情況復雜，原料受氣候條件限制，可收集時間較短，收集條件較為苛刻；另外，國產機械設備相對落后，技術及質量標準體系不完善，使這一問題格外突出。國家發展改革委、農業部、財政部在2011年11月發布的《“十二五”農作物秸稈綜合利用實施方案》中提出“秸稈收儲運體系工程”的概念，要求探索建立有效的秸稈田間處理、收集、儲存及運輸系統模式。因此，應加快建立以市場需求為引導，企業為龍頭，專業合作經濟組織為骨干，農戶參與，政府推動，市場化運作，多種模式互為補充的秸稈收集儲運管理體系。此外，若能在家庭經營基礎上推進農業經營體系的創新，推進耕地的適度規模經營，不僅可增加農民收入，也無形中增加了可獲取農林廢棄物資源量，降低收集難度，取得雙贏效果。
二是纖維素酶成本。酶成本（占總成本的20%～30%）是僅次于原料成本的另一項大支出。由于纖維素酶的比活力明顯低于淀粉酶，從而使纖維素乙醇的用酶量是淀粉乙醇用酶量的25～50倍。除了酶的自身生產成本外，酶制劑的精制、運輸等過程的成本約占總成本1/3以上。根據酶的不同活性，在高干物濃度條件下，纖維素酶加入量通常約占木質纖維素原料總質量的5%～10%，而且酶解72h或者更長時間原料到糖的轉化率才超過85%。同時與淀粉酶相比，纖維素酶轉化效率［g糖/（g酶·h）］低99%以上，成本高出約20～30倍。表2對比了淀粉乙醇和纖維素乙醇酶解指標。
三是發酵效率。目前先進的玉米乙醇技術，發酵60～70h醪液乙醇濃度可達到15%（質量分數），發酵效率達到2.4g乙醇/（L·h）。而纖維素酶解液中混合糖濃度偏低（約14%），經預處理產生的乙酸等酵
母抑制物濃度較高（2～5g/L），同時，基因工程菌株對戊糖、己糖代謝的不同步性也延緩了整個發酵過程，因此，一般發酵60h后，乙醇濃度僅達到5%（質量分數），發酵效率約0.8g乙醇/（L·h），僅為玉米乙醇的1/3。可見，無論是發酵菌株，還是發酵工藝還有較大的提升潛力。表3對比了淀粉乙醇和纖維素乙醇發酵指標。
四是能耗和水耗。能耗方面，主要是預處理和低濃度發酵液精餾的蒸汽消耗。為了保證纖維素原料的糖化效率，預處理過程必須維持足夠強度。從精餾的角度考慮能耗時，問題則更為突出，乙醇濃度小于5%時，乙醇濃度每提高1個百分點精餾能耗都會明顯下降。乙醇濃度的提高將使水耗成比例下降。
五是專用裝備。預處理物料酶解時，20%～30%濃度的底物起始黏度高達5000～8000mPa·s，但在酶解2～5h后，黏度會迅速降低至100mPa·s以下。為使高固、高黏物系下，酶和物料快速均勻混合，充分發揮酶的作用，必須深入研究模擬高固、高黏物料流變性質，為開發高效的酶解反應器提供設計依據。
2纖維素乙醇關鍵技術進展
2.1預處理
纖維素原料由纖維素、半纖維素和木質素3部分組成，木質素和半纖維素形成的結合層緊緊地包圍著纖維素，阻礙了纖維素酶與纖維素的接觸，處理過程中可溶性抑制物的形成使得原料預處理成為纖維素乙醇發展的瓶頸。研究證實，預處理過程的費用占總成本的20%左右，是除了原料和酶制劑之外成本比例最大的部分。因此，開發一種高效率、低能耗、低成本的預處理方法是研究重點。
為此，各國研究者嘗試了大量預處理方法。已有的處理方法分為物理、化學和生物法或者是它們的綜合使用。主要有機械粉碎、蒸汽爆破、氨爆破、稀酸處理、堿處理、濕氧化處理、超臨界二氧化碳處理、超臨界水處理、有機溶劑處理、生物降解等，現有示范裝置考慮到經濟性一般采用蒸汽爆破的方法。實現纖維素乙醇的生產，要求預處理盡可能提高纖維素和半纖維素收率，保證后續酶解獲得更多的可發酵糖，避免使用對環境污染嚴重和對反應器要求較高的化學品，處理條件應相對溫和。
原料固體含量的提高會產生一些反應器設計和生物過程操作上的工程問題。“氣-液-固”多相發酵體系的黏度急劇增加，會使系統混合、傳質和傳熱效率急劇下降。
另外，預處理不僅對過程本身具有重要影響，還幾乎影響到纖維素乙醇工程的其他所有部分，包括纖維素生物質原料選擇、預處理水解液脫毒、預處理后物料的酶解發酵水平、精制過程能耗、廢水處理工藝等，需要在整體工藝、技術經濟層面作綜合考量。
2.2酶解
纖維素酶解及酶制劑是當前纖維素乙醇工程的一個核心課題。木質纖維素的特殊結構使纖維素酶水解反應的可及性差，酶解前原料必須進行預處理。反應過程中酶的活性降低，需要消耗較多的酶制劑，反應時間長，而且酶解轉化的效率低。特別是目前的酶制劑成本仍偏高。另外，木質纖維素原料一般含有較多的半纖維素，為提高原料利用率和乙醇產量，還要用到降解半纖維素的β-木糖苷酶和木聚糖酶等。實際中，酶解過程由一系列酶蛋白協同完成木質纖維素的降解。
長期以來，酶制劑成本問題一直是阻礙纖維素乙醇產業發展的障礙。20世紀90年代，1加侖（1加侖=3.785升，下同）纖維素乙醇的酶成本約為5美元。為了降低酶費用，美國能源部為諾維信和杰能科公司提供資金研究纖維素糖化酶，2012年諾維信公司推出酶制劑產品Cellic CTec3，其轉化效率比上一代CTec2提高了50%，拓寬了溫度和酸堿度的適應范圍，將纖維素乙醇的生產成本由2.5美元/加侖降至2.0美元/加侖。杰能科公司在同年推出的纖維素復合酶Accellerase® TRIO在Accellerse DUET基礎上，提高了處理高濃度底物的能力，酶用量減少一半，可用于同步糖化共發酵（SSCF）工藝。荷蘭帝斯曼公司也推出了商業應用的纖維素水解酶。諾維信公司和帝斯曼公司酶制劑產品針對稀酸汽爆預處理底物進行復配，杰能科公司被杜邦公司并購后，主要針對氨爆預處理底物復配優化酶制劑。中性預處理物料需要酶制劑有更高的半纖維素酶活力和更強的抗抑制物能力。這些成果都為纖維素乙醇的商業化奠定了基礎。表4詳細列出了主要的商業化纖維素酶生產商的產品及應用。
2.3發酵
國內外對纖維素乙醇發酵的研究主要集中在兩個方面：一是高產和高耐受力菌株的選育，二是發酵工藝的研究。
過去十幾年的研發重點是菌株。菌株來源可以是自然界微生物資源中篩選的各種細菌、酵母、絲狀真菌，也可以是現有乙醇發酵工業菌株。對于近千年人工篩選的釀酒酵母和經歷幾十年選育的運動發酵單胞菌這類工業菌株來說，具有發酵濃度高、耐受環境脅迫能力強的先天優勢。因此，目前纖維素乙醇工業化菌株大多來源于工業酵母。通過基因工程技術改造普通釀酒酵母使其能夠代謝戊糖生產乙醇的研究已持續了近20年。表5為幾種主要商業化共發酵菌株性能的比較。經過基因改造和環境篩選，工業菌株已具備耐受高濃度抑制物、同時利用C5和C6糖、不通氣條件發酵的能力，糖醇轉化率可達40%～48%。共發酵菌株的優勢是非常明顯的，2013年在4000噸/年的纖維素乙醇試驗裝置上進行的測試表明，C5/C6糖共發酵菌株較之前的C6發酵菌株的乙醇得率提高40%。
菌株改造的方式多種多樣，成熟的有誘變育種、定向篩選、代謝工程等，此類方法常常面臨后續繁重的篩選工作，且容易在過量表達某些靶基因后引起整個代謝網絡的失調，而不能達到預期效果。新興的系統生物學、合成生物學的方法對此進行了補充和提升，可以通過系統生物學的方法充分理解細胞的整體代謝網絡，以及環境脅迫因素對其內部調控的影響；通過合成生物學設計新的代謝途徑，使用更有效的不同源或修飾后的酶系統，避開原有代謝通路的限制。這些方法的應用，預計會解決目前的一些難題，如C5/C6糖的發酵不同步（引進外源木糖高效專一轉運系統）、抑制物導致的C5糖轉化效率低等，從而大幅提高產品的得率及生產效率。
發酵工藝研究十分活躍，有時也將酶解與發酵兩步工藝一起考慮。已有的工藝主要包括：分步糖化發酵（SHF）、同步糖化發酵（SSF）、同步糖化共發酵（SSCF）和統合生物加工（CBP）工藝等。雖然SSF工藝可消除酶制劑的部分產物抑制作用，減少酶制劑用量，縮短反應周期，節省設備投資，但由于目前酶解和發酵反應的最優溫度相差較大，商業化的纖維素乙醇裝置一般使用SHF工藝。CBP工藝化繁為簡，將多糖水解酶的生產、水解糖化、C5/C6共發酵等多個過程使用一種或多種微生物在同一反應器內一步完成，是發酵工藝的終極目標，但難度很大。目前的CBP工藝尚未成熟，乙醇終濃度較低，其主要原因是尚未開發出既能有效分泌全部CBP所需的酶，又具備高產、高耐受能力的微生物或微生物集群。但CBP工藝仍是未來的發展方向，有研究預計，若采用成熟的CBP工藝取代SSCF工藝，生物轉化過程將節約3/4的成本，木質纖維素生產乙醇的整體工藝將節約1/2的成本。
3展望
目前的示范裝置仍處于技術經濟考核階段，還會出現一些新問題，若能從整體工藝優化、整個系統經濟性的角度出發，可能會采用更有效的組合方式降低預處理強度，提高酶制劑和發酵菌株的性能。如在預處理過程中，不同工藝及條件的選擇不僅會關系到處理效果的好壞，也會影響處理原料的要求，酶解所需酶制劑的復配方式和用量（涉及不同酶蛋白類型和數量的組合），發酵液中抑制物的濃度，以及污水中的COD、硫酸根或氨氮負荷強度，因此預處理和其他工段需要加強協同和配合，以最終的能耗和經濟性為目標，找到整體工藝的平衡點。
在纖維素乙醇示范裝置的建設中，跨行業企業的合作已經越來越多，商業運作模式在未來將進一步完善，纖維素乙醇生產商與酶制劑公司及乙醇菌株公司將進一步加強合作，發展原位產酶/菌株、用酶/菌株的模式，從而大幅度降低酶制劑/菌株在精制、運輸和包裝方面的成本。
截至2012年底，世界纖維素乙醇專利申請已超過4000件，新型預處理技術、新菌株、新型酶制劑、代謝途徑等相關研究成果不斷涌現。隨著新技術的發展、成熟，相關的技術成果會在工業界得到應用。如通過理性設計的蛋白質工程技術提高生物過程的效率和穩定性；利用合成生物學等尖端技術補充成熟基因工程的方法，通過自下而上重新修改和組裝細胞工廠的單元、部件，一方面可提高生物系統中目標產物（如乙醇）的產率，將副產物（如乙酸、甘油等）通過重組體系也轉化為目標產物，另一方面，優化脅迫耐受性的基因組成和表達調控方式，使菌株更好地適應工業生產過程（如溫度波動、低pH、抑制物、雜菌等）。
此外，乙醇發酵碳原子利用效率的問題也有望通過設計新的代謝途徑加以解決。有研究構建了非氧化糖酵解（NOG）途徑，可使戊糖、己糖中全部的碳轉化為乙酰輔酶A（CoA），并可與CO2的固定及其他C1化合物的同化途徑相結合，實現100%的碳轉化為所需的燃料和化學品。還有研究在酵母代謝途徑中插入外源酶基因，將抑制物乙酸轉化為乙醇，同時消耗在木糖代謝過程中可能盈余的NADPH，使輔酶利用更加平衡，木質纖維素發酵生產乙醇的產量增加10%。
隨著整體工藝優化的不斷探索和實踐、傳統能源化工企業與生物技術企業更緊密合作模式的建立，以及新技術、新成果在產業化裝置的應用，纖維素乙醇的技術經濟性有望實現突破，從而推動纖維素燃料乙醇產業的健康發展。 |
