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李大偉1，孟范平1，崔鴻武1，2
（1.中國海洋大學海洋環境與生態教育部重點實驗室，山東青島266100；2.中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東青島266071）
摘要：將1株產油淡水微藻——微擬球藻（Nannochloropsis sp.MASCC11）分別接種到青島市2家市政污水處理廠（STP）的尾水中，根據其生長、油脂產率和營養鹽去除情況，評價了利用STP尾水培養微藻以生產富油的藻生物質同時深度凈化尾水的可行性。結果表明，團島污水處理廠（TD-STP）和李村河污水處理廠（LC-STP）尾水中無機氮和磷酸鹽的濃度雖然遠低于BG11培養基，但仍能支持微藻生長，而且以未經稀釋的尾水更具優勢，培養8d后，藻生物量分別達到BG11培養基中生長微藻的65.23%和44.77%。STP尾水經稀釋后處于營養鹽缺乏狀態，有利于藻細胞內脂質積累，但是油脂產率最大值（10.5mg·L-1·d-1）仍出現在未經稀釋的TD-STP尾水中，為未稀釋LC-STP尾水的1.37倍。LC-STP尾水中微藻的油脂產率較低，可能與該處理廠接納工業廢水而在尾水中殘留較多有害物質有關。在微藻的直接和間接作用下，TD-STP和LC-STP尾水中磷酸鹽的去除率分別達到94.5%和100%；無機氮的去除率較低（分別為59.2%和45.4%），與尾水中初始N/P較高有關。上述結果表明，與接納工業廢水的污水廠相比，處理生活污水的污水廠所排尾水較適于培養產油微藻，能夠實現產油微藻低耗培養與尾水深度凈化相耦合。
目前，中國城鎮污水處理廠（STPs）采用的二級處理工藝大多能使廢水中污染物濃度降至《城鎮污水處理廠污染物排放標準（GB18918—2002）》[1]規定的標準值以下。但是，由于出水排放量較大，隨之外排的營養鹽（N和P）數量依然較大。假定所有二級處理的出水水質均達到GB18918—2002[1]的一級A標準（總氮T-N15mg·L-1、氨氮NH4+-N5或8mg·L-1、總磷T-P1mg·L-1），按2015年全國城鎮污水處理廠處理的污水總量為428億m³計[2]，那么每年向外部水環境排放的T-N為642000t、氨氮為214000或342400t、T-P為42800t。這些氮磷營養鹽排入江河湖海后，會刺激浮游植物生長，導致水體富營養化。此外，氨氮即使在低濃度時也會對魚類和水生生物產生毒性[3]。因此，如何在現有二級處理工藝基礎上進一步削減氮磷營養鹽的外排量非常必要。但是，以營養鹽為目標的深度處理技術存在以下問題[3]：操作成本高，需要技術熟練的人員；采用好氧生物過程時需要曝氣，從而增加能耗；采用化學處理過程則需要使用大量化學物質，而且會生成大量污泥。因此，必須尋找一種簡單、有效和可持續的方法以達到深度脫氮除磷的效果。
微藻是一類單細胞光合自養生物，具有生長速度快、油脂含量高的優點，能夠通過光合作用吸收利用氮磷營養鹽和無機碳，并轉化為糖類、蛋白質和脂質，而其中的脂質又可作為生產生物柴油的原料，因此，藻基生物柴油被認為是生物能源中最具發展潛力的一種新型能源[4]。但是，傳統的微藻培養方式需要消耗大量的氮磷營養鹽。有研究估計[5-6]，在藻基生物柴油的生產過程（微藻養殖→收獲→油脂提取→轉酯化）中，微藻養殖成本約占生物柴油總生產成本的70%，其中40%來自養殖過程中對水和養分的消耗。過高的生產成本已成為制約藻基生物柴油商業化生產的主要瓶頸[7]。有報道認為，只有當第三代生物柴油（即藻基生物柴油）的生產成本降低10倍，才能在價格上與原油競爭[8]。因此，利用廉價的水資源和營養物質培育微藻，成為促進微藻生物能源技術實際應用的最直接、最有效的途徑。從理論上講，將污水處理廠的尾水深度凈化與微藻培養相結合，不僅可以進一步去除尾水中的營養物質，而且還能利用這些營養物質生產藻生物質進而用于制備生物柴油，大大降低藻基生物柴油的生產成本，因而是一種環境效益顯著、可持續性強的發展理念。在將這種理念成功應用之前，尚需解決以下問題：來自不同STPs的尾水是否均適于微藻培養、將尾水稀釋后能否促進微藻油脂積累、利用尾水培養微藻時氮磷營養鹽的濃度能被削減到何種程度。
微擬球藻屬（Nannochloropsis）在分類學上屬于真眼點藻綱（Eustigmatophyceae），該屬微藻不僅生長速度快、光合效率高，而且油脂含量高，因而被認為是一類富油的模式微藻[9]。目前，國外已建立了基于微擬球藻的多種封閉式光生物反應器和室外開放池培養體系[10-11]。該屬已定種的微藻（N.gaditana，N.sali-na，N.granulata，N.oceanica和N.oculata）均為海洋微藻[12]。考慮到污水處理廠所排尾水的鹽度較低，較適于淡水微藻培養。本研究將1種淡水微擬球藻（Nannochloropsissp.MASCC11）引入青島市2家STPs的尾水中進行培養，根據培養期間的微藻生長速率、油脂產率等相關指標回答上述問題，為實現微藻的高效低耗培養提供理論依據。
1材料與方法
1.1試驗材料
1.1.1試驗藻種 淡水微擬球藻（Nannochloropsis sp.MASCC11）由中國科學院青島海洋研究所提供。其細胞為圓形或橢圓形。試驗前將微藻接種到BG11培養基中[13]，在溫度（25±1）℃、光強60μmol photons·（㎡·s）-1、光暗周期24h：0h條件下預培養至指數生長期，備用。
1.1.2試驗尾水 取自青島市的團島污水處理廠（TD-STP）和李村河污水處理廠（LC-STP）。試驗前一天，分別于1：00、7：00、13：00、19：00采集每座污水處理廠的二沉池出水，按等體積比混合后，沉淀24h，于121℃高壓滅菌20min后備用。尾水的水質（見表1）符合GB18918—2002[1]的一級A標準（pH=6~9；CODCr50mg·L-1；T-N15mg·L-1；T-P0.5mg·L-1）。
1.1.3儀器 TU-1810型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；血球計數板（Nikon公司）；YS2-H型光學顯微鏡（日本尼康公司）；JY92-II型超聲波細胞粉碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）；PGX-250D型智能光照培養箱（江蘇艾利森儀器制造有限公司）；7670530型真空冷凍干燥儀（美國Labconco公司）；YXQ-LS-50S型高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅實業有限公司醫療器械廠）。
1.2 STPs尾水培養微藻
用自來水將尾水稀釋，稀釋比（EDR=V尾水/V尾水+自來水）分別為20%、40%、60%、80%和100%，滅菌后用于微藻培養。將15只1000mL錐形瓶分為5組，每組的瓶中各加入一種EDR的稀釋尾水400mL，接種指數生長期的微藻（初始藻細胞密度約1.3×106cells·mL-1）。將所有錐形瓶置于智能光照培養箱的搖床（150r/m）中，連續培養8d（基本到達平臺期），培養條件同1.1.1節。培養期間，每天測定藻細胞密度，培養結束時測定藻生物量和油脂含量。培養前、后，分別測定各處理組的無機氮、磷酸鹽濃度。
1.3生物學指標測定
1.4化學指標測定
無機氮：分別采用納氏試劑分光光度法[16]、紫外分光光度法[17]、萘乙二胺分光光度法[18]測定氨氮、硝態氮、亞硝態氮的濃度，三者之和為無機氮濃度。
磷酸鹽：樣品不進行消解，直接采用鉬酸銨分光光度法[19]測定。
1.5營養鹽的去除量（△C）和去除率（η）
1.6數據統計與分析
各指標測定的結果均以3次重復測定值的“平均值±標準差”（mean±SD）表示。使用Origin9.0繪圖。使用SPSS17.0軟件進行數據分析。采用雙變量Pear-son相關性分析，探究藻生物量、總脂含量與營養鹽初始濃度、去除量之間的關系，統計顯著性水平為P<0.05和P<0.01。
2結果
2.1淡水微擬球藻在不同EDR尾水中的生長和生物量
由圖1可見，淡水微擬球藻在兩家STP的尾水中均可生長，各處理組的藻細胞密度隨時間延長不斷增加，未出現延滯期，但是變化幅度因尾水來源和EDR的不同而異：在TD-STP尾水的5個處理組中（見圖1（a）），微藻生長較快，培養結束時的藻細胞密度在（475.9~598.6）×104cells·mL-1之間，比生長速率（r）總體上隨著稀釋程度的增大（即EDR減?。┒档停畲笾担?.191d-1）出現在EDR100%（即未經稀釋的尾水）處理組中（見表2）。在LC-STP尾水的5個處理組中，微藻生長較慢，培養結束時的藻細胞密度在（323.2~488.5）×104cells·mL-1之間，只有EDR100%處理組的r值（0.165d-1）較大，為TD-STP尾水相應EDR處理組的86.4%，隨著EDR減小，r值總體上呈降低態勢（P<0.05）（見圖1（b）和表2）。
根據圖2，在5種EDR的TD-STP尾水中培養8d后，淡水微擬球藻的生物量在0.161~0.287g·L-1之間，最大值仍出現在EDR100%處理組中，顯著高于其它EDR處理組（P<0.05）。同樣，在LC-STP尾水培養體系中，EDR100%處理組的藻生物量最大（0.197g·L-1），而且顯著大于其它處理組。當EDR相等時，LC-STP尾水處理組的藻生物量總是低于TD-STP尾水處理組，差值在0.041~0.103g·L-1之間。
2.2不同EDR尾水中淡水微擬球藻的油脂合成
由表3可見，TD-STP尾水培養的微藻中，油脂含量總體上隨著EDR的增大而降低，最低值（29.30%）出現在EDR100%處理組，最高值出現在EDR20%處理組（41.35%）。LC-STP尾水各處理組的微藻油脂含量之間無顯著差異（P>0.05）。但是，從微藻的油脂產率看，最大值均出現在2種尾水的EDR100%處理組中，且TD-STP尾水中的油脂產率（10.50mg·L-1·d-1）為LC-STP尾水的1.37倍。
2.3淡水微擬球藻對不同EDR尾水中無機氮和磷酸鹽的去除
圖3顯示了微藻接種于各尾水處理組中培養8d后的無機氮剩余濃度和去除量。從圖中可見，無機氮去除量總體上隨EDR的增大而增多，其去除率在TD-STP尾水中基本保持在60%左右，而LC-STP尾水EDR較小的處理組中無機氮去除率較高（66.7%~70.1%），在EDR較大的處理組中則明顯偏低（35.8%~45.4%）。
根據圖4，培養8d后，LC-STP尾水各處理組的無機磷均未檢出（即：去除率均達到100%）；TD-STP尾水各處理組的無機磷去除率均高于80%，在EDR80%處理組中甚至達到99.4%。
2.4尾水中營養鹽初始濃度、去除量與藻生物量、油脂合成的關系
根據上述結果進行的相關性分析發現（見表4），每種尾水中無機氮、磷的初始濃度均與藻生物量呈顯著正相關（P<0.01或P<0.05），而與微藻油脂含量呈負相關（在TD-STP尾水中達到顯著水平，P<0.01）。同樣，無機氮、磷的去除量與藻生物量、油脂含量之間也存在類似相關性。與LC-STP尾水相比，TD-STP尾水中氮磷指標與生物學指標之間具有較好的相關性。
3討論
3.1STP尾水可以替代傳統培養基用于淡水微擬球藻培養
氮和磷均為微藻生長的必需營養物質[20]，相應的，配制微藻培養基（BG11[13]、BBM[21]等）時，必須加入氮鹽（多為硝酸鹽）和磷鹽（多為磷酸氫鹽）。例如，在BG11培養基中，NO3--N的濃度為247.1mg·L-1，PO43--P的濃度為9.2mg·L-1，二者的比值（N/P）為26.9。根據之前的研究[22]，將該微藻（初始密度為1.5×106cells·mL-1，與本研究的1.3×106cells·mL-1十分接近）接種于BG11培養基中，在同樣的培養條件下培養10d，測得生物量為0.44g·L-1，r值為0.27d-1。
本研究所用的STP尾水中氮磷營養鹽濃度（TD-STP尾水含無機氮13.83mg·L-1、PO43--P0.122mg·L-1；LC-STP尾水中二者濃度分別為9.27和0.034mg·L-1，大大低于BG11培養基（相差1~2個數量級）。即便如此，淡水微擬球藻仍可在2種尾水中生長（見圖1），而且在未經稀釋的尾水（EDR=100%）中生長較快，培養8d后的生物量分別達到上述BG11培養基中藻生物量[22]的65.23%和44.77%，r值分別為70.74%和61.11%。換言之，這些STP尾水可以替代傳統培養基用于微藻培養。
微藻在LC-STP尾水中生長較慢（見圖1、2和表2），原因有兩個：①該尾水中無機氮、磷酸鹽的初始濃度較低，而這兩種營養鹽的初始濃度均與藻生物量呈顯著正相關（見表4）。特別是，該尾水中濃度過低的磷酸鹽（僅約為TD-STP尾水的1/4）在培養期間會很快被微藻吸收而耗盡。這從圖4可清晰看到：培養結束時，各EDR處理組中的磷酸鹽均未被檢出，而TD-STP尾水各EDR處理組中尚殘存少量磷酸鹽。由此推測，LC-STP尾水中磷酸鹽在培養結束前已不存在，使微藻處于磷饑餓狀態。已有研究證明[23]，與氮饑餓相比，磷饑餓對微藻生長的抑制作用更大。這是因為，磷不僅參與碳水化合物在藻細胞內不同細胞器之間的轉運，更重要的是直接參與能量（如ATP）的代謝。②兩家STP所接納處理的廢水種類不同。據調查，TD-STP主要處理生活污水，而LC-STP主要處理工業廢水。雖然兩廠均采用二級處理工藝，但是尾水中有害物質的殘余濃度可能存在很大差異。眾所周知，與生活污水相比，工業廢水中一般含有較多的重金屬和難降解有機污染物。我國現行的《城鎮污水處理廠污染物排放標準》（GB18918—2002）[1]中的基本控制項目并未包括重金屬和有機污染物指標，而大多數集中式污水處理廠在設計污水處理工藝時也未將重金屬作為進出水的水質指標[24]。這就使得以處理工業廢水為主的STP尾水中有毒物質濃度較高。有關重金屬、有機污染物對微藻生長的不利影響已有很多報道[25]，例如，Cd2+能抑制葉綠素合成、引起藻細胞內活性氧（ROS）積累進而造成細胞氧化損傷等。再如，前期研究發現[26]，當STP尾水中紅霉素（一種抗生素）濃度達到100μg·L-1時，斜生柵藻（Tetradesmus obliquus）的生長會受到明顯抑制。因此，微藻在LC-STP尾水中生長緩慢和生物量較低，可能是磷饑餓和有毒物質共同作用的結果。今后的研究應加強2種尾水中有毒物質種類、濃度的比較，以確定影響微藻油脂合成的污染因子。
3.2STP尾水的來源及其稀釋比對淡水微擬球藻油脂合成影響很大
對于TD-STP尾水，EDR較低（20%、40%）的處理組中微藻的油脂含量較高。這主要是因為，較大程度的稀釋造成尾水中營養鹽初始濃度降低。表4的結果支持這種判斷：該尾水的初始氮、磷濃度均與微藻的油脂含量呈顯著負相關（P<0.05）。很多研究已證實[23，27-28]，氮、磷缺乏造成的脅迫會促進藻細胞中的脂質積累。而且氮、磷的缺乏程度越大，微藻越容易積累油脂[27]，嚴重逆境脅迫下微藻將以脂質（而非淀粉）作為主要儲能物質，這有利于抵御外界環境變化，實現機體自我保護[22]。但是，在LC-STP尾水的各處理組中，這種負相關性并不顯著（即：油脂含量并未隨著EDR降低而明顯增加）。這是因為，雖然LC-STP尾水中初始濃度較低的營養鹽有利于油脂積累，但是尾水中較多的有害物質（見3.1節的分析）可能會抑制油脂合成。有研究指出[25]，某些重金屬在中、低濃度時能夠促進微藻合成油脂，而過高濃度的重金屬反而抑制油脂合成。例如，楊金水等[25]報道，將產油微藻（Auxenochlorella protothecoides UTEX 2341）在含Cd2+的IM培養基中培養7d，當Cd2+濃度在0.6~3mmol/L（即0.067~0.336mg·L-1）的范圍內時，微藻的油脂產量隨Cd2+濃度增大逐漸增加，但是當Cd2+濃度繼續增大時，油脂產量顯著降低。至于LC-STP尾水中哪些有毒物質能夠抑制微藻中油脂的合成，則需要通過全面的水質監測確定濃度較高的有毒成分，進而逐一進行它們對微藻油脂合成的影響試驗才能確定。
Li等[29]將養豬廢水（NH4+-N：（477±3）mg·L-1、TN：（519±7）mg·L-1、PO43--P：（31±1）mg·L-1）與厭氧消化后的養豬廢水（NH4+-N：（720±6）mg·L-1、TN：（792±4）mg·L-1、PO43--P：（33±0.1）mg·L-1）分別按不同比例（5%~20%和2.5%~10%）稀釋后，用于培養鏈帶藻（Desmodesmussp.EJ8-10），14d后，各處理組的油脂含量在18.7%~28%左右，油脂產率在2.9~5.7mg·L-1·d-1。與之相比，本研究使用的STP尾水中氮磷濃度遠低于上述文獻中的養殖廢水，但是接種淡水微擬球藻培養8d后能夠獲得更高的油脂含量與油脂產率。這表明STP尾水比養殖廢水更適于產油微藻培養，而且，培養周期縮短意味著培養裝置體積和占地面積的減少，有利于降低基建投資。還有學者[30]在TAP培養基中額外添加甲醇與乙醇（各10g·L-1），進行異養微藻培養，18d后，兩個試驗組的油脂產率分別為9.4與8.9mg·L-1·d-1，低于本研究中未經稀釋的TD-STP尾水處理組水平（10.5mg·L-1·d-1）。這也說明廉價的STP尾水在培養產油微藻方面具有較大優勢。在TD-STP尾水各處理組中，雖然EDR100%處理組的微藻油脂含量最低，但是油脂產率卻最大，這是由于該處理組的藻生物量最高所致。另外注意到，與之前采用BG11培養基培養同種微藻時的油脂含量（20.58%）[22]相比，所有尾水處理組的微藻油脂含量（29.30%~41.35%）均明顯提高。可見，利用尾水替代傳統培養基培養微藻，能夠促進油脂合成。這其中固然有氮磷營養鹽缺乏的貢獻，但是與氮磷共存的成分也可能影響到油脂的合成，需要進一步研究才能明確。
3.3微藻作用下STP尾水中氮磷的去除
在未經稀釋（即EDR=100%）情況下，TD-STP尾水中的無機氮、磷濃度分別為13.83和0.12mg·L-1，LC-STP尾水中無機氮、磷濃度分別為9.04和0.03mg·L-1，其它EDR處理組中無機氮、磷的初始濃度隨EDR減小而相應降低。接種微藻8d后，各處理組的無機氮、磷均有明顯去除。營養鹽去除的機制包括微藻同化作用及其介導的物理化學過程兩方面[31]：①微藻可以直接吸收尾水中的NH4+-N（含NO2--N和NO3--N轉化生成的NH4+-N）和正磷酸鹽（磷在污水中的存在形式之一[32]），并利用外部光照和空氣中CO2進行光合作用，合成微藻自身的生物質。②光合過程必然伴隨著體系pH的升高[33]，當pH值大于9時，氨揮發和磷酸鹽沉淀等過程會對營養鹽去除產生較大影響[34-35]。有研究認為，氨揮發可造成廢水中高達32%的無機氮去除[36]。Wang和Lan[37]認為，廢水中初始濃度高的NH4+有利于pH值穩定，因為微藻對NH4+的吸收會引起pH值下降，從而阻止pH值上升。但是，本研究所用的STP尾水中NH4+-N濃度不足4mg·L-1，在微藻培養1d后即觀察到pH上升，第2天以后基本維持在pH=10.5（TD-STP尾水）和pH=10.0（LC-STP尾水）左右（數據未列出）。因此認為，微藻對NH4+-N的吸收利用和氨揮發共同造成尾水中無機氮的去除。至于培養結束后EDR100%的處理組中無機氮尚有一定剩余、而磷酸鹽已基本耗盡，主要是由于尾水中的初始N/P比（質量濃度比：TD-STP115.3、LC-STP265.9）過高所致。Zhang等[38]利用人工配制的模擬尾水培養小球藻（Chlorellasp.HQ）30d發現，最適于尾水中營養鹽去除的初始N/P范圍為8~20；當控制N的初始濃度為15mg·L-1、而P的濃度由1.3mg·L-1逐漸降為0.3mg·L-1時，N的去除率將由90.7%減少為72.4%。由此可見，在利用STP尾水培養微藻時，通過調整污水處理工藝，優化STP尾水中的氮磷含量及比例，將降低初始N/P比而使無機氮去除效果得到明顯改善。此外，培養期間并未觀察到體系中生成沉淀物，這與Diniz等[33]的試驗結果相同，可能是由于尾水中磷酸鹽初始濃度較低以及微藻的快速吸收所致。
3.4利用STP尾水培養產油微藻與深度凈化尾水的可行性
在以處理生活污水為主的STP所排尾水中，產油微藻可以快速生長并獲得較高油脂產率。利用這種培養介質替代傳統培養基，能夠大大降低產油微藻的養殖耗費（因為無需專門提供水源和投入養分），由此可使藻基生物柴油的生產成本降低40%左右[7]，有利于縮小藻基生物柴油與石油來源的柴油在價格上的差距，加快實現其商業化生產的目標。此外，這種舉措能夠在不改變污水處理廠現有工藝流程（只需將尾水轉入含微藻的反應器中即可）的基礎上，進一步去除尾水中的氮磷營養鹽，降低尾水受納水域的污染負荷，獲得經濟和環境的雙贏效果。今后應在適當增大培養規模的基礎上，通過微藻收獲、油脂提取、轉酯化過程，獲得生物柴油成品，進而根據整個過程中的原材料消耗量、產品生成量以及市場價格，進行效費分析，以系統評價STP尾水替代傳統培養基的經濟效益和環境效益。
4結論
?。?）STP尾水中無機氮、磷酸鹽的濃度雖然遠低于BG11培養基，但仍能支持淡水微擬球藻的生長，而且微藻在未經稀釋的尾水中更具生長優勢，在相似的培養條件下，TD-STP和LC-STP尾水中的藻生物量可分別達到BG11培養基的65.23%和44.77%。
（2）在稀釋后的STP尾水中，營養鹽較為缺乏，有利于微藻細胞中脂質的積累，但是油脂產率仍以未經稀釋的尾水處理組最高，其中，微藻在TD-STP尾水中的油脂產率達到LC-STP尾水的1.37倍。
?。?）在微藻作用下，未經稀釋TD-STP和LC-STP尾水中磷酸鹽的去除率達到94.8%以上，而無機氮去除率較低（59.2%和45.4%），這可能與尾水的初始N/P較高有關。
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