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張錦濤1，2，3倪晉仁1，3周順桂2
(1、北京大學深圳研究生院城市人居環境科學與技術重點實驗室 廣東深圳 518055)
(2、廣東省生態環境與土壤研究所，廣東省農業環境綜合治理重點實驗室 廣州 510650)
(3、北京大學環境工程系水沙科學教育部重點實驗室 北京 100871)
摘 要：微生物燃料電池(Microbial fuelcel，lMFC)是未來理想的發電裝置，而鐵還原菌是目前MFC研究中重要的產電微生物。自然界中并無微生物產電的直接進化壓力，而MFC電極與自然界中Fe(III)氧化物同為難溶性胞外電子受體，研究表明，鐵還原菌對二者的還原有相似機制。基于鐵還原菌的MFC具有無需外加介體，可利用多種有機電子供體作為燃料，能量轉化率高等優點。本文分析了鐵還原菌還原電極和還原Fe(III)氧化物機制的相似性，對近年來基于各種鐵還原菌的MFC研究進展進行分述和總結，提出了鐵還原菌MFC的發展趨勢和研究方向。
隨著全球氣候變暖和化石燃料耗竭等問題的日益嚴峻，可替代能源和可再生能源的研究受到越來越多的重視。構建多樣的、更穩定的能源系統，已成為各國可持續發展和國家戰略的重要組成部分。太陽能、風能、生物質能等可再生能源產業的發展方興未艾。近年來，一種能直接將化學能轉化為電能的發電裝置——微生物燃料電池，以其特有的優點，逐漸成為新興能源領域的研究熱點。
微生物燃料電池(Microbial fuelcell簡稱MFC)，是以微生物為催化劑將化學能直接轉化為電能的燃料電池。由于它在能量轉化過程減少了燃燒步驟，因而可大幅提高能量轉化效率。同常規燃料電池相比，MFC以微生物代替昂貴的催化劑，因而具有更多優點：1)常溫常壓條件下運行；2)無需為防止催化劑中毒提純燃料；3)原料來源更廣泛。理論上，所有可生物降解的有機物都可作為MFC的燃料，因而可利用污水中的有機污染物發電。MFC在處理有機廢物的同時產生電能，相比傳統的耗能污水處理工藝可有效降低運行成本。
目前，微生物燃料電池的研究正處于實驗室或小試水平，電池輸出功率比較低(一般小于10W/m2 陽極面積)。為有效降低內阻，消除極化，提高輸出功率密度，主要工作集中在以下幾個方面：1)電池構型的改進優化；2)適于MFC的先進電極材料的研制與使用；3)運行參數的優化等。而作為MFC的催化劑，微生物氧化有機物并還原電極(即向陽極傳遞電子)的速率是影響MFC電能輸出提高的主要內因。因此，對MFC中具有胞外電子傳遞活性的微生物(產電微生物，Electricigenicm icroorganisms)及其電極還原機制的研究，不僅有助于闡明MFC中的產電呼吸代謝途徑，而且有利于進一步提高MFC性能，具有重要的理論意義與應用價值。
1 MFC中的產電微生物及其電極還原機制
由于細胞膜的阻隔，多數微生物細胞內代謝反應產生的電子并不能傳遞到胞外，因而不表現出直接的電化學活性。為此，大多數常規的微生物燃料電池需要采用某些小分子的氧化還原活性物(也稱為介體，Mediator)充當電子穿梭載體，將胞內的電子轉移至電極表面。在MFC中，可人為地添加介體促進電子傳遞。常用的介體包括中性紅、硫堇、AQDS(蒽醌-2，6-二磺酸)，及各種吩嗪、吩噻嗪等。這些介體很多是雜環類化合物，對人體有毒，不能直接排放到環境中。除了外源添加，某些微生物自身也能分泌介體。例如， Rabaey等發現，銅綠假單胞菌(Pseudom onasaeruginosa)能夠合成綠膿菌素(Pyocyanin)作為介體，將電子傳遞至陽極。然而，微生物合成介體是耗能過程，而且介體容易隨著基質更新而損失，從而降低了電子供體(燃料)的利用效率。因此，無介體MFC是微生物燃料電池的研發重點。
混合菌MFC的主要接種物有廢水、活性污泥和水體底泥等。研究者發現，當MFC運行一段時間后，陽極菌群結構較接種物發生顯著變化，具有產電活性的微生物得到富集。
例如，16SrRNA研究表明，以底泥為接種物或基質的MFC中，陽極表面富集的D-proteobacteria可高達70%，其中以地桿菌屬(Geobacter)為主。這些地桿菌屬細菌能夠在無介體條件下，以電極為唯一電子受體，將一些簡單有機物徹底氧化成二氧化碳和水，并從中獲取生長所需的能量。目前，已發現的產電微生物有：嗜水氣單胞菌(Aerom onashydrophila)，丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，腐敗希瓦氏菌(Shewanell aputrefaciens)，硫還原地桿菌(Geobactersul furreducens)，鐵還原紅育菌(Rhodoferaxferrireducens)，丙酸脫硫葉菌(Des-ulfobulbus propionicus)，Shewanella oneidensis，Geothrixferm entan，Geopsychrobacterelectrodiphilus等。
目前已發現的微生物還原電極的方式主要有以下3種：1)直接接觸機制；2)通過氧化還原介體作為電子穿梭體；3)利用納米導線遠距離傳遞電子(圖1)。
由于輸出功率的限制，現有的微生物燃料電池離實際應用還有很大差距，其中有可能在短期內投入實際應用的是底泥燃料電池(圖2)，它可以用于驅動偏遠海域中的低能耗傳感器。底泥燃料電池(SedmentmicrobialfuelcellSMFC)工作原理是：以產電微生物(主要是地桿菌屬細菌)為催化劑，將底泥中的有機物(如乙酸等)徹底氧化，產生的電子被微生物傳遞到陽極，然后通過外電路到達陰極，從而形成回路產生電流。在SMFC中，發酵微生物的作用是將復雜的有機質降解為發酵產物(如乙酸等)，供富集在陽極的產電微生物利用，兩者"接力"完成復雜有機質的徹底氧化與產電。
2微生物電極還原與Fe(III)氧化物還原
由于自然界中并未發現對產電呼吸代謝(Electricigen icrespiration metabolism)的直接進化壓力，因而推測，自然界中可能存在其它因素導致微生物電極還原能力的形成。鐵在地殼中平均含量為516%，是地殼中豐度排第二的金屬。鐵在自然界中主要以難溶性Fe(III)氧化物形式存在。作為地球生命古老的呼吸類型，微生物還原Fe(III)氧化物的能力經歷了長期的進化選擇，并且在元素的生物地球化學循環中扮演著重要角色。與自然界中的Fe(III)氧化物一樣，電極也是難溶性的胞外電子受體。
基于電極與Fe(III)氧化物作為電子受體的相似性，有人推測，微生物將胞內代謝產生的電子傳遞到電極表面的機制可能與其還原Fe(III)氧化物(也稱鐵呼吸)的能力有關。
韓國科學家從長期運行的MFC中分離出兩株鐵還原菌，即嗜水氣單胞菌(AeromonashydrophilaPA3)和丁酸梭菌(Clos-tridiumbutyricumEG3)。循環伏安法和MFC實驗證明，在厭氧條件下它們不僅可還原Fe(III)，而且可以還原電極產電。
Holmes等以Fe(III)氧化物為電子受體，從海水SMFC陽極表面分離到富集的鐵還原菌Geopsychrobacterelectrodiphilus，該菌在SMFC電極還原中起主要作用。鐵還原菌1(Fe(III)-re-ducingbacteria，簡稱FRB2是指能夠異化還原Fe(III)并從中獲取生長所需能量的微生物。自從1987年Lovley首次在淡水底泥中發現金屬還原地桿菌(GeobactermetallireducensGS15)以來，人們已經分離到鐵還原細菌100多株。陸續實驗證明，許多鐵還原菌具有電極還原活性，可進行產電呼吸代謝。鐵還原菌的多樣性與廣泛性，為MFC催化劑的選擇提供了廣闊空間。
鐵還原菌對難溶性Fe(III)氧化物的還原主要有4種機制：(1)鰲合劑促溶機制，即細胞釋放鰲合劑促進Fe(III)氧化物溶解，然后再還原溶解態Fe(III)；(2)直接接觸機制，即鐵還原菌通過細胞外膜上的電化學活性蛋白將電子傳遞到Fe(III)氧化物表面；(3)電子穿梭機制，即利用自然環境中廣泛存在的腐殖質、植物根系分泌物或細胞自身合成的
氧化還原介體作為電子穿梭體，將電子傳遞給Fe(III)氧化物；(4)納米導線輔助機制，即在特定條件下某些鐵還原菌會形成類似菌毛的導電附屬物，細菌可以納米導線遠距離向固體電子受體(如鐵氧化物、電極等)傳遞電子，從而免除了細胞表面與電子受體的直接接觸，有效增大了反應面積。
由于電極是永久性胞外電子受體，不同于還原后消失的Fe(III)氧化物，因此，電極還原不存在類似鰲合劑促溶的機制，而與后3種Fe(III)氧化物還原方式相關。例如，Nevin等在研究細菌還原Fe(III)氧化物的機制時發現，Geothrixfer-mentans能分泌一種水溶性醌類物質，這種醌類物質可作為電子穿梭體加速Fe(III)還原。而在基于G。fermentans的MFC研究中，他們同樣發現細菌可以自身合成介體，促進細胞對電極的電子傳遞。但這兩種介體是否同一物質，有待進一步分離鑒定。Gorby等研究ShewanellaoneidensisMR-1的納米導線時發現，細胞色素MtrC和OmcA基因缺陷株的納米導線不能導電，進而失去還原Fe(III)氧化物的能力，同時降低在MFC中的產電活性，說明該菌可利用導電的納米導線向電極或Fe(III)氧化物傳遞電子。
再如，地桿菌屬(Geobacter)細菌在還原Fe(III)氧化物時并不產生介體或鰲合劑，但可以利用細胞色素向Fe(III)氧化物傳遞電子。Mehta等發現，兩種外膜細胞色素C，即OmcS和OmcE，在Geobactersulfurreducens還原難溶Fe(III)氧化物中起著重要作用。敲除omcS基因后，G.sulfurreducens喪失還原Fe(III)氧化物的能力，但能夠繼續還原可溶性Fe(III)。而敲除omcE的突變株，經過一段時間培養，可緩慢恢復還原Fe(III)氧化物的能力，但較野生株弱。重新表達兩種蛋白，突變株可再還原Fe(III)氧化物。定量RT-PCR分析表明，相對于以可溶性的Fe(III)為電子受體，G.sulfurredu-cens在MFC條件下(即以電極為電子受體)，omcS轉錄水平增加19倍，且omcS轉錄水平隨電流增大而增加，敲除omcS抑制電流產生。在MFC條件下，omsE轉錄水平也有所提高，且OmsE基因缺陷株經過適應性馴化可逐漸恢復產電水平，但比野生株稍低。盡管OmcS和OmcE在Fe(III)氧化物和電極還原中的具體作用有待進一步研究，但上述結果表明，G. sulfurre-ducens還原Fe(III)氧化物和電極時有相似的機制。
總之，大量研究證明，微生物電極還原與Fe(III)氧化物異化還原具有相似機制，二者相互借鑒，有助于深入理解胞外電子傳遞機制。
3基于鐵還原菌的MFC研究概況
目前報道的基于鐵還原菌的MFC，大多無需外加介體，部分菌還能從電子傳遞過程中獲取生長所需的能量，并以電極為唯一電子受體徹底氧化多種有機電子供體，電子回收率較高(表1)。這類產電微生物在MFC應用中有兩個優點：一是徹底氧化有機物達到較高的能量轉換率；二是微生物從電子傳遞過程中獲取生長所需能量，實現代謝活性的自我維持，有利于MFC長期運行。
以下分別對報道過的主要鐵還原菌MFC的特點及研究進展進行總結。
3.1 基于S.putrefaciens的MFC
Km等在研究S.putrefaciens代謝乳酸產電時，最早提出微生物能直接將電子傳遞到電極表面的設想。但S.putrefa-ciens在MFC中的生長時，大多數細胞處于游離狀態，僅有少量細胞覆蓋于電極表面形成生物膜，因而容易隨基質的更換而流失。當向MFC中新鮮基質中加入不同濃度的細胞時，初始電勢隨濃度升高而增大，與循環伏安法測得的電化學活性結果一致。推測S.putrefacien依靠細胞表面的電化學活性物質(如細胞色素C)，向電極傳遞電子。由于以電極為受體時只能不完全氧化有限的電子供體，如乳酸、丙酮酸等，電子回收率較低，因而，S.putrefaciens并非理想的MFC催化劑。
3.2基于S. oneidensis的MFC
Ringeisen等在研究微型MFC(橫截面積210cm2 ，體積112cm3)時使用兼性厭氧菌S. oneidensis作為催化劑，以乳酸為電子供體，按橫截面積和陽極體積計算最大輸出功率密度分別為3W/m2 、500W/m3，但電子回收率低于10%。S.oneiden-sis向電極傳遞電子的機制可能包括直接接觸機制、電子穿梭機制或納米導線輔助機制，但3種機制對電子傳遞的貢獻率并未進一步研究。微型MFC設計能夠有效減少擴散距離，增加單位體積的陽極表面積，可有效提高功率輸出密度，但S.one-densis利用電子供體(燃料)的利用效率過低，可考慮采用其它菌種提高電子回收率。
3.3 基于G. sulfurreducens的MFC
G.sulfurreducens是最早報道的，能夠直接利用電極還原的能量生長的微生物。基因組序列信息的闡明，有利于深入了解細胞與電極表面相互作用的機制，G. sulfurredu-cens已成為目前產電代謝研究中的熱點微生物。
基于G.sulfurreducens的MFC主要依靠附著在陽極上的細胞傳遞電子。激光共焦掃描顯微觀察發現，隨著輸出電流增強，陽極表面覆蓋的細胞數量增加，逐漸形成由多層細胞組成的高度結構化的生物膜。對不同電流下陽極生物膜的生物量分析表明，電流強度和生物量線形正相關。當達到最大輸出電流時，生物膜平均厚度為40Lm。活性染色觀察發現，生物膜中離電極表面較遠的細胞仍具有產電代謝活性，并且參與對電極的電子傳遞，這些細胞遠距離傳遞電子與其表面導電的菌毛有關。這些長約20Lm的菌毛相互交錯纏繞，構成滲透在生物膜中的/納米電網0，有效促進了遠距離的電子傳遞。
G.sulfurreducens菌毛缺陷株不能還原Fe(III)氧化物，但可轉化乙酸產電，電流輸出較野生株弱。活性染色觀察表明，只有緊靠陽極電極表面的缺陷型細胞具有產電活性，推測這些細胞能夠通過外膜細胞色素C，如OmcS，向電極傳遞電子。
G.sulfurreducens在沉積環境中還原Fe(III)氧化物時，并未發現類似于在電極上堆積形成細胞膜傳遞電子的現象，可能由于Fe(III)氧化物不同于可作為永久電子受體的電極，形成細胞膜并不利于消耗Fe(III)氧化物后轉移到其它位置。該現象是微生物自身的適應性變化，也意味著通過基因工程或馴化的方法有可能能很大程度提高微生物還原電極的能力。
3.4 基于R.ferrireducens的MFC
R.ferrireducens是最早報道的能將葡萄糖的徹底氧化與Fe(III)還原偶聯的兼性厭氧微生物。其他許多鐵還原菌，如Geobacteraceae中的一些種屬，雖然能直接向電極傳遞電子，但電子供體局限于簡單有機酸，如乙酸、乳酸等。當向MFC加入糖或其它較復雜的有機物作為燃料時，還需要發酵細菌將其降解為簡單有機酸后才能被利用。而R.ferrireducens能以電極為唯一電子受體直接氧化葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖等生成CO2，并從電子傳遞中獲得生長所需的能量。當以葡萄糖為電子供體時電子回收率可達81%。R.ferrireducens最適生長溫度為25e，但在4e下仍能生長并還原Fe(III)，它在低溫下還原電極的能力未作報道，有待進一步考察。基于R.ferrireducens的MFC具有蓄電池的特點，如反復充放電時其蓄電能力無明顯減弱，充電快速，儲存較長時間電池性能保持穩定等。
3.5基于D.propionicus的MFC
D.propionicus是最早發現的能從難溶性Fe(III)氧化物還原中獲取生長所需能量的硫酸鹽還原菌。它是Desulfobul-baceae的代表種，其主要代謝方式是通過不完全氧化有機酸如乳酸、丙酸、丁酸和乙醇等異化還原硫酸鹽。當缺乏電子受體時，還能通過琥珀酸-丁酸途徑發酵乳酸、丙酮酸或乙醇生成乙酸和丙酸的混合物。在MFC中，D.propionicus能夠以乳酸、丙酸、丙酮酸或氫為電子供體，向電極傳遞電子并維持生。根據反應物和產物的化學平衡計算，以丙酮酸鹽為電子供體時，D.propionicus還原電極的同時還進行丙酮酸發酵，同以難溶Fe(III)氧化物為電子受體時的混合代謝類似。因此，MFC電子回收效率較低，僅有2614%的丙酮酸代謝與陽極電子傳遞偶聯。更換新鮮基質，MFC能夠迅速恢復電流輸出水平，說明附著在電極表面的細胞在陽極電子傳遞中起主要作用。由于不能利用乙酸作為電子供體，一般認為D.propionicus在海水SMFC電極還原中不會起重要作用。但底泥中的硫化物可被電極非生物氧化產生單質硫，沉淀在燃料電池陽極表面，而D.propionicus能夠將硫氧化成硫酸鹽并向電極傳遞電子。因此，在含硫化物豐富的環境中，可形成電極非生物還原與由D.propionicus催化的生物還原并存的MFC。此發現豐富了對海水SMFC生物產電機制的認識。
3.6基于G.fermentans的MFC
G.fermentans是從石油污染的鐵還原環境中分離的嚴格厭氧菌，能以Fe(III)為唯一電子受體徹底氧化多種簡單有機酸和棕櫚酸，是最早報道的淡水環境中能夠通過Fe(III)還原氧化長鏈脂肪酸的微生物。它以電極為唯一電子受體時，能夠徹底氧化乙酸、琥珀酸、蘋果酸、乳酸、丙酸等簡單有機酸，而以乙酸為電子供體時的電子回收率可高達94%。
研究表明，G.fermentans還原電極時，采取了類似還原難溶性Fe(III)氧化物的策略——合成介體加速電子傳遞至不溶性胞外電子受體。但更換陽極室中的基質，MFC可保持近50%的產電能力，并且在新基質中數周內未檢測到電子穿梭體，說明覆蓋在電極表面的細胞可能以某種方式阻止介體釋放到基質中或者這些細胞能直接向電極表面傳遞電子。
3.7基于G. electrodiphilus的MFC
Homes等從海水SMFC陽極表面分離到兩株獨特的耐寒細菌G.electrodiphilusA1 T 和A2，可在4e時生長，并能還原多種可溶和難溶Fe(III)。以可溶性Fe(III)為電子受體時，可氧化多種有機酸、氨基酸、長鏈脂肪酸、芳香族化合物。G.elec-trodiphilus在MFC中能徹底氧化的有機酸包括乙酸、蘋果酸、延胡索酸和檸檬酸等，電子回收率在90%左右。A1T和A2的16SrRNA序列與SMFC陽極表面主導電子傳遞的微生物有90%~97%的相似性，說明G.electrodiphilusr在海水SMFC電極還原中起主要作用。考慮到其在低溫海底環境中生長的優勢，G.electrodiphilus可作為模式菌，深入研究海水底泥燃料電池中微生物與電極的相互作用機制，優化電極還原能力，以推動SMFC在驅動偏遠海域傳感器中的應用。
4研究展望
基于鐵還原菌的MFC無需外加介體，可利用多種有機物作為燃料，能量轉化率高，具有很高的研究及應用價值。但目前為止，MFC轉化燃料的速率過低，輸出功率有限，是制約實際應用的瓶頸。篩選能夠快速轉化有機物產電的鐵還原菌，已成為推動MFC發展的迫切需要。篩選適于MFC的鐵還原菌主要有以下3種途徑：1)直接從運行良好的MFC陽極分離，分離時應盡量使用難溶Fe(III)氧化物作為電子受體，并使生理條件(如pH、溫度、電子供體等)接近原生境；2)借鑒Fe(III)氧化物還原的研究成果，考察相關鐵還原菌的電化學活性，也是獲得優良MFC菌種的重要途徑；3)通過基因工程構建高效產電菌株。
目前，鐵還原菌MFC在電化學優化方面的研究較為落后。今后應結合鐵還原菌基因組和電極還原機制等方面的研究成果，改進電池構造，采用特殊電極材料，優化運行參數，推動鐵還原菌MFC應用研究的快速發展。此外，考察如何有效利用發酵細菌與鐵還原菌的協同效應，擴大燃料利用譜，提高MFC在生活污水、畜禽糞便、淀粉廢水等有機廢棄物處理領域的應用潛力，也將有效加快MFC投入實際應用的步伐。 |
