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陳勝杰，高翔，袁戎宇
（廣東怡和科潔科技有限公司，廣州佛山528000）
摘要：研究并改進(jìn)了傳統(tǒng)的分段水解與發(fā)酵工藝（SHF）流程，提高了發(fā)酵液中乙醇質(zhì)量濃度。通過5次快速循環(huán)，提高了工藝過程中的酶解和發(fā)酵效率；新工藝發(fā)酵液中乙醇質(zhì)量濃度最高達(dá)到26.4g/L（主循環(huán)中的循環(huán)1），主循環(huán)的平均乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到25.3g/L，比原工藝的19.6g/L分別提高了34.7%和29.1%；酶解時(shí)間120h，比原工藝縮短了28.7%；發(fā)酵時(shí)間150h，比原工藝縮短了10.7%；每千克玉米秸稈的纖維素酶和木聚糖酶添加量分別為101mL和123mL，比原工藝分別降低了36.9%和29.7%，酵母菌的使用量為27mL，比原工藝降低了40%。新工藝有效提升了酶解和發(fā)酵效率，對后續(xù)研究具有借鑒意義。
纖維素乙醇被視為新世紀(jì)極有潛力代替化石燃料的可再生能源之一，同時(shí)也是許多其他產(chǎn)品原料的理想替代品[1]。但其規(guī)模化生產(chǎn)仍存在諸多問題，例如預(yù)處理過程產(chǎn)生的抑制物對后續(xù)酶解及發(fā)酵的負(fù)面影響是其中比較棘手的一環(huán)[2]。玉米渾身是寶，果實(shí)可以作為糧食儲備?釀酒原料，秸稈和玉米芯可以作為纖維質(zhì)原料生產(chǎn)乙醇，玉米漿是廉價(jià)的工業(yè)發(fā)酵碳源[3]。目前，秸稈木質(zhì)纖維素乙醇發(fā)酵的工藝繁多，SHF工藝（即分段水解與發(fā)酵法，Subsection hydrolysis and fermentation process ）是比較常見的一種工藝，其將水解糖化和發(fā)酵分開進(jìn)行，發(fā)酵初期的葡萄糖質(zhì)量濃度較高，對發(fā)酵產(chǎn)生抑制，而且發(fā)酵過程中后糖化產(chǎn)生的葡萄糖對水解酶具有部分抑制作用，使其活性降低，造成后糖化作用較弱，間接導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間的延長[4]，因此發(fā)酵速度較慢。通常SHF工藝的水解和發(fā)酵階段效率較低，不能滿足量產(chǎn)要求[5]。
筆者主要以實(shí)驗(yàn)室原有的SHF工藝為基礎(chǔ)，改善其水解發(fā)酵過程，將水解發(fā)酵過程從單一循環(huán)，拆分成5個(gè)主循環(huán)，同時(shí)引入支路循環(huán)，對主循環(huán)酶水解不徹底的不溶物進(jìn)行二次深度水解和發(fā)酵。在木質(zhì)纖維素生物煉制燃料乙醇的工藝中，酶通常比較昂貴，支出較大，本改進(jìn)工藝將對水解酶和釀酒酵母菌進(jìn)行循環(huán)利用，提高原料的使用率，降低水解酶的投入量。研究對后續(xù)的纖維素乙醇規(guī)模化生產(chǎn)提供一定的借鑒意義。
1材料與方法
1.1材料
YPD種子培養(yǎng)基[6]：蛋白胨20.0g/L，酵母粉10.0g/L，葡萄糖20.0g/L，pH6.5~6.8，121℃，20min高壓蒸汽滅菌；葡萄糖單獨(dú)滅菌，115℃?15min高壓蒸汽滅菌，無菌條件下加入。
發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨7.5g/L，酵母粉5.0g/L，葡萄糖10.0g/L，pH6.5~6.8，121℃?20min高壓蒸汽滅菌；葡萄糖單獨(dú)滅菌，115℃?15min高壓蒸汽滅菌，無菌條件下加入。
種子和發(fā)酵培養(yǎng)基所需成分均購自國藥集團(tuán)，分析純；玉米秸稈，購自山東聊城；纖維素酶和木聚糖酶，購自山東蔚藍(lán)青島；釀酒酵母購自安琪酵母；其他常用試劑均購自市售，化學(xué)純。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1玉米秸稈預(yù)處理方法
采用高溫稀酸預(yù)處理方法，玉米秸稈干重占比為10%，即100g干秸稈加900g質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的H2SO4溶液，150℃?0.2MPa預(yù)處理30min，得到預(yù)處理秸稈混合物，共計(jì)1000g。實(shí)驗(yàn)以處理1000g預(yù)處理玉米秸稈混合物（即100g干玉米秸稈）為標(biāo)準(zhǔn)，分別對傳統(tǒng)SHF工藝和改進(jìn)后的SHF工藝進(jìn)行對比研究。
1.2.2傳統(tǒng)的分步水解發(fā)酵工藝（SHF）
溫度為50℃，pH為4.8，攪拌轉(zhuǎn)速120r/min，采用液體纖維素酶和木聚糖酶進(jìn)行酶解，其酶活分別為8500U/mL和80000U/mL，投放量分別為160mL/kg玉米秸稈干物料和175mL/kg玉米秸稈干物料，持續(xù)時(shí)間為7d；之后將上清液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐中，調(diào)整pH至5.5，溫度下降至32℃，加入釀酒酵母發(fā)酵菌液，接種量為V（種子液）∶V（發(fā)酵液）=1∶20，初始OD600為5，開啟發(fā)酵階段[7]，持續(xù)時(shí)間為7d。具體工藝流程如圖1所示。
1.2.3改進(jìn)工藝
將SHF工藝過程優(yōu)化為5個(gè)循環(huán)，對水解酶和釀酒酵母進(jìn)行循環(huán)利用，并在后3次循環(huán)中分出支路水解G發(fā)酵體系，對上一循環(huán)中的水解不溶物進(jìn)行深度二次水解，并循環(huán)利用上一循環(huán)的部分釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵，得到乙醇。工藝為50℃?pH4.8?120r/min酶水解處理24h，5000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液至發(fā)酵罐，pH調(diào)節(jié)至5.5，溫度降至32℃，釀酒酵母接種量為V（種子液）∶V（發(fā)酵液）=1∶20，初始OD600為5，150r/min處理30h，其工藝流程如圖2所示。圖2中，每次循環(huán)開始，在水解步驟中添加相同質(zhì)量的新鮮玉米秸預(yù)處理混合物，第2~5次循環(huán)中水解酶的添加量為第1次的50%。第2~4次循環(huán)中離心得到的酶水解不溶物-酶，分出25%轉(zhuǎn)移到支路水解瓶中，其他條件同第一次循環(huán)，但對應(yīng)酶添加量為第一次循環(huán)的15%~17%，發(fā)酵結(jié)束后離心回收酵母細(xì)胞，分出20%轉(zhuǎn)移到支路發(fā)酵瓶中，對支路酶水解液發(fā)酵。第5次循環(huán)結(jié)束后工藝終止。為了保證發(fā)酵效率的穩(wěn)定，從第2次循環(huán)開始，在利用回收酵母發(fā)酵的基礎(chǔ)上，均額外加入新鮮酵母（接種量為V（種子液）∶V（發(fā)酵液）=1∶40）[8]。主循環(huán)和支路循環(huán)的水解瓶和發(fā)酵瓶均在1.5L的三角搖瓶中進(jìn)行。
1.3檢測方法
1）葡萄糖質(zhì)量濃度檢測采用SBA-40E生物傳感儀檢測[9]。
2）以下成分均用高效液相色譜法進(jìn)行，且均采用外標(biāo)法和峰面積積分法測定：乙醇檢測條件為Biorad Aminex HPX-87H色譜柱，柱溫50℃，流動相5mmol/LH2SO4，流速0.6mL/min，RID檢測器（35℃）[10]；木糖的檢測條件為Biorad Aminex HPX-87H色譜柱，柱溫55℃，流動相5mmol/L H2SO4，流速0.6mL/min，RID檢測器（35℃）[11]。
1.4產(chǎn)率計(jì)算方法
5次循環(huán)后，將每次循環(huán)得到的發(fā)酵上清液進(jìn)行混合，集中檢測乙醇質(zhì)量濃度Ethmax（單位為g/L）。
2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
2.1玉米秸稈成分分析
對原料玉米秸稈進(jìn)行成分分析，結(jié)果如表1所示。
由表1可知：本研究采用的玉米秸稈中的葡聚糖和木聚糖含量較高，經(jīng)過稀酸高溫預(yù)處理，其釋放率均在90%以上，預(yù)處理效果較好[13]。
2.2主循環(huán)發(fā)酵糖質(zhì)量濃度和乙醇測定
主循環(huán)的酶水解液中葡萄糖和木糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖3所示。
由圖3可知：5次循環(huán)的葡萄糖質(zhì)量濃度均高于原工藝的葡萄糖質(zhì)量濃度，最高為循環(huán)1，達(dá)36.2g/L，之后隨著循環(huán)次數(shù)的增加輕微下降；木糖質(zhì)量濃度也表現(xiàn)出了相似的趨勢，循環(huán)1的為最高，達(dá)17.2g/L，之后隨著循環(huán)次數(shù)的增加輕微下降。
筆者著重分析了主循環(huán)中的水解和發(fā)酵過程中糖的質(zhì)量濃度以及乙醇產(chǎn)量，支路循環(huán)的具體數(shù)值如表2所示。在乙醇平均得率Q的計(jì)算中，主路與支路循環(huán)按每個(gè)循環(huán)的實(shí)際發(fā)生時(shí)間，即30h計(jì)算，總循環(huán)按150h計(jì)算，傳統(tǒng)SHF按168h計(jì)算。
由表2可知：5次主循環(huán)的乙醇產(chǎn)量?糖醇轉(zhuǎn)化率以及乙醇平均收率均比較平穩(wěn)且高，數(shù)值波動較小，支路循環(huán)也保持了相同的趨勢，整體的循環(huán)和傳統(tǒng)SHF相比具有明顯優(yōu)勢。
主循環(huán)發(fā)酵液中的乙醇質(zhì)量濃度也表現(xiàn)出類似酶水解的趨勢，如圖4所示。最高乙醇質(zhì)量濃度出現(xiàn)在循環(huán)1階段，達(dá)26.4g/L，之后隨著循環(huán)數(shù)的增加輕微下降，5次主循環(huán)的平均乙醇質(zhì)量濃度為25.3g/L，比原工藝的19.6g/L分別提高了34.7%和29.1%。殘?zhí)欠矫妫?次主循環(huán)發(fā)酵液中的葡萄糖基本消耗完，木糖消耗量較低，均在25%以下。
2.3工藝參數(shù)對比
筆者工藝與傳統(tǒng)工藝的各參數(shù)對比如表3所示。支路酶水解-發(fā)酵因與主路發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行，故耗時(shí)并未計(jì)算在內(nèi)，以主路耗時(shí)為準(zhǔn)。支路每次循環(huán)加入少量水解酶，不加入新鮮酵母（具體流程見圖2），其中，纖維素酶酶活8500U/mL，木聚糖酶酶活80000U/mL；酵母菌起始OD600為5。
由表3可知：工藝改進(jìn)后的各參數(shù)均較原工藝有了明顯提升。其中，酶解時(shí)間縮短了28.7%；發(fā)酵時(shí)間縮短了10.7%；纖維素酶添加量和木聚糖酶添加量分別降低了36.9%和29.7%；酵母菌加入量降低了40%；乙醇平均得率提高了43.3%；糖醇轉(zhuǎn)化率提高了1.94%。
2.4討論
筆者通過改進(jìn)傳統(tǒng)SHF工藝，以期提高工藝過程的各項(xiàng)指標(biāo)，為纖維素乙醇擴(kuò)大生產(chǎn)提供理論依據(jù)。從對比結(jié)果看，5次主循環(huán)的酶水解效率基本平穩(wěn)，保持較高的糖降解率，但隨著循環(huán)數(shù)增加而呈現(xiàn)輕微衰減趨勢。原因可能是隨著循環(huán)數(shù)的增加，重復(fù)利用的部分水解不溶物G酶中含有水解抑制物，如葡萄糖和乙酸等[14]。快速的酶水解可以有效避免中后期水解液中抑制物對酶的抑制，Jin等[10]研究發(fā)現(xiàn)，緩慢長時(shí)間的酶水解和發(fā)酵過程，將大大降低水解率和發(fā)酵糖醇轉(zhuǎn)化率，且在23h后抑制物的量會明顯增加，因此筆者將酶水解過程拆分成5個(gè)循環(huán)，每次酶水解時(shí)間均在24h以內(nèi)。5次主循環(huán)的發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化效率也較為平穩(wěn)，這得益于舊發(fā)酵液的及時(shí)排出和新鮮發(fā)酵液和菌種的及時(shí)引入，使整個(gè)循環(huán)的發(fā)酵過程穩(wěn)定高效[15-16]。
在節(jié)約水解酶投入量方面，新工藝比原有工藝也有較大改進(jìn)，新工藝中纖維素酶和木聚糖酶的添加量分別為10.1mL和12.3mL，比原工藝分別降低了36.9%和29.7%。通常水解酶的消耗是纖維素乙醇工藝中成本占比較大的一環(huán)[17]，因此新工藝明顯降低了水解酶帶來的成本壓力。
本研究也有一些不足之處需要在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中改進(jìn)，比如在引入支路循環(huán)的過程中轉(zhuǎn)移酶水解液和不溶物會造成損耗，并且引入的支路循環(huán)需要額外的酶水解瓶和發(fā)酵瓶，在擴(kuò)大生產(chǎn)中，這種改進(jìn)需要增加設(shè)備成本的投入。基于此，筆者會在后續(xù)研究中進(jìn)一步優(yōu)化相關(guān)工藝，篩選構(gòu)建出能適應(yīng)相對高溫的生產(chǎn)菌[18]，研究釀酒酵母同時(shí)利用葡萄糖和木糖的機(jī)理[19]，提高乙醇產(chǎn)量。
3結(jié)論
筆者改進(jìn)原有的SHF工藝，將其劃分為5個(gè)主循環(huán)，并引入3次支路循環(huán)，在同樣的秸稈處理量（100g）條件下，相對于原工藝，其各方面指標(biāo)均有不同程度改善。其中，發(fā)酵液中乙醇質(zhì)量濃度最高達(dá)到了26.4g/L（主循環(huán)1），主循環(huán)的平均乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到了25.3g/L，比原工藝的19.6g/L分別提高了34.7%和29.1%；酶解時(shí)間縮短到120h，比原工藝縮短了28.7%；發(fā)酵時(shí)間縮短到150h，比原工藝縮短了10.7%；纖維素酶和木聚糖酶添加量分別為10.1mL和12.3mL，比原工藝分別降低了36.9%和29.7%；酵母菌的使用量為27mL，比原工藝降低了40%。研究對纖維素乙醇的規(guī)模生產(chǎn)提供一定的借鑒作用。
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